Mabtech FluoroSpot Kit 螢光免疫斑點套組

FluoroSpot 偵測細胞分泌多種細胞因子的聰明方法 Fluorospot原理和ELISpot相同,但是利用螢光為基礎的偵測系統,可以在同一個孔中偵測細胞分泌兩種不同的細胞因子。Fluorospot特別適合多功能的T細胞分析,定義為可以分泌多種細胞因子,和保護預防傳染病例如HIV高度相關。

Mabtech
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FluoroSpot與ELISPOT(Enzyme-linked immunospot)原理相同,將最後偵測方式改成螢光。現在已經被廣泛用來偵測細胞分泌的特定反應因子,包括細胞激素(Cytokine)、趨化激素(Chemokine)或是顆粒酵素(Granzyme)。尤其在偵測免疫相關細胞 ( B細胞,T細胞,Monocytes,macrophages,dendritic cells )所分泌的抗體或細胞激素,用來分辨免疫細胞亞型。FluoroSpot方法操作簡單,靈敏度更高,尤其偵測同一顆細胞同時分泌多種細胞激素時,可各自定量不受干擾。臨床上已經應用在判斷肺結核( TB )病人為潛伏期或已發病,有相當好的辨識效果。

FluoroSpot Logo

 

FluoroSpot除了有ELISPOT的偵測敏感度之外,還可以單個樣品進行多種細胞因子的偵測。細胞實驗可以大量且容易執行,適合單次或是大規模的檢測。Mabtech提供FluoroSpot相關試劑,可以同時偵測兩種或三種細胞因子。



應用範圍

  • COVID-19
  • 疫苗製備
  • 癌症研究
  • 單核球/樹突細胞/巨噬細胞研究
  • 病毒研究
  • 過敏原檢測
  • 疾病研究
  • 預防檢測

應用方向

因 FluoroSpot 可以分析 T 細胞和 B 細胞的功能與數量,且具備了靈敏度更高、檢體使用量更低等特點,因此在多個應用方向中, FluoroSpot 已成為其中的標準分析工具。



FluoroSpot優勢

  • 操作簡單 : 只需放入細胞刺激後,再呈色反應
  • 靈敏度高 : 可達單顆細胞層級,有利於偵測少量細胞分泌激素
  • 節省時間 : 可同時偵測兩種以上細胞因子
  • 可大量篩選 : 96well 高通量快速進行實驗
  • 細胞需求量更小 : 相對於ELISPOT,需要更少量細胞完成相同分析
  • 接近體內真實狀況 : 細胞激素一分泌立即被捕獲


FluoroSpot最多有四色螢光

human-il22-ifng-il5-il17a-fluorospot-四種螢光表現

excitation 380 nm/emission 430 nm (LED380)
excitation 490 nm/emission 510 nm (LED490, FITC) for 490-reagent detection excitation 550 nm/emission 570 nm (LED550, Cy3) for 550-reagent detection excitation 640 nm/ emission 660 nm (LED640, Cy5) for 640-reagent detection


實驗原理

FluoroSpot 實驗原理和ELISPOT相似,差別在最後以螢光方式呈色,再用不同濾鏡分別分析。更可以應用在同時偵測兩個以上細胞因子的分析上。

FluoroSpot Step Coating1

Coating

A mixture of capture antibodies is added to all wells of an ethanol- treated PVDF membrane plate.

FluoroSpot Step Cell incubation2

Cell incubation

Cells are added in the presence or absence of stimuli and the plate is in-cubated to allow cytokine secretion.

FluoroSpot Step Cytokine capture3

Cytokine capture

Secreted cytokines bind to the capture antibodies surrounding the activated cells.

FluoroSpot Step Detection antibodies4

Detection antibodies

The cells are removed and a mixture of tag-labeled and biotinylated detection antibodies is added.

FluoroSpot Step Fluorophore labeled conjugates5

Fluorophore-labeled conjugates

A mixture of fluorophore-labeled anti-tag antibody and streptavidin-fluorophore conjugate is added.

FluoroSpot Step Analysis6

Analysis

The plate is analyzed in a fluor- escence reader fitted with separate filters for the different fluorophores.


實驗流程

  1. 披覆抗體
  2. 置入細胞
  3. 抗體標示
  4. 螢光標示
  5. 斑點計數


FluoroSpot分析

Mabtech已經發展 FluoroSpot試劑,可以在同一個孔位分析多個細胞因子,靈敏度更高,也更節省細胞用量。

  • 分析多功能T細胞在感染、癌症、過敏和自體免疫疾病中的狀況
  • 監測並分辨疫苗所引發的T細胞反應,用於疫苗開發中保護確效
  • 分析T細胞所分泌的特殊細胞激素 ( 如Th1和Th17 )
  • 決定在過敏或免疫治療中,Th1 / Th2的反應程度
  • 計數B細胞所分泌不同種類專一性抗體 ( 如IgG和IgA )


T-cell FluoroSpot

FluoroSpot 適合測試特殊Tcell的反應。

T細胞被廣泛應用在研究特別的免疫反應,例如 : 特異性免疫反應、癌症、過敏和自身免疫性疾病。可用來開發與監控新疫苗和候選疫苗。

FluoroSpot T-cell IFN-γ

FluoroSpot T-cell IL-2

FluoroSpot T-cell Overlay

Human IFN-γ/IL-2 dual FluoroSpot


B-cell FluoroSpot

B-cell FluoroSpot 是用來研究抗體免疫反應的強大工具。主要的應用包括偵測B細胞對感染和接種引起的反應。可以同時定性與定量細胞分泌的抗體。

FluoroSpot B-cell IgG

FluoroSpot B-cell IgM

FluoroSpot B-cell Overlay

Human IgG/IgA/IgM triple FluoroSpot


其他細胞 FluoroSpot

FluoroSpot 適合用於分析樹突細胞(dendritic cells), 單核細胞(monocytes),巨噬細胞(macrophages)。

FluoroSpot other cell TNF-α

FluoroSpot other cell Overlay

Human IL-6/TNF-α dual FluoroSpot


螢光分析

搭配自動化讀盤儀器,可利用濾片來區分不同螢光表現,進而分析。

  • FITC (490/510 nm)
  • Cy3 (550/570 nm)
  • Cy5 (640/660 nm)
  • DAPI

FluoroSpot Analysis



文獻選讀

疫苗開發
2015 Oncoimmunology

Antitumor immunization of mothers delays tumor development in cancer-prone offspring.

G.Barutello et al. 分析動物經由疫苗施打後的 T 細胞和 B 細胞的功能與免疫反應。

癌症研究
2019 Cancers

Human Colorectal Carcinoma Infiltrating B Lymphocytes Are Active Secretors of the Immunoglobulin Isotypes A, G, and M.

C.S. Mullins et al. 分析新鮮切除的原發性和繼發性結直腸癌(CRC)中的浸潤腫瘤 B 細胞 (TiBc) 分泌免疫球蛋白之功能性。

疾病診斷
2020 Nature Communications

α-Synuclein-specific T cell reactivity is associated with preclinical and early Parkinson’s disease.

C. S L. Arlehamn et al. 觀察 α-synuclein (α-syn) 特異性T細胞和 PD 的相關性,並受試者中 CD4+, CD8+ T細胞功能與數量,應用於帕金森氏症早期診斷。

C. S L. Arlehamn et al.
過敏檢測
2019 Frontiers in Immunology

Variability in German Cockroach Extract Composition Greatly Impacts T Cell Potency in Cockroach-Allergic Donors.

G. Birrueta et al. 分析過敏與非過敏受試者的免疫圖譜變化。

2019 Clin Exp Allergy

Identification and characterization of a naïve CD8 + T cell repertoire for benzylpenicillin

R. Bechara et al. 利用 IFN‐γ ELISpot加上IFN‐γ/Granzyme‐B Fluorospot assays測試Granzyme‐B的分泌,測量 CD8+ T cell 對 BP 的特異性與活性機制。

預防檢測
2018 Immunology Methods

A multicolour HLA-specific B-cell FluoroSpot assay to functionally track circulating HLA-specific memory B cells.

Sergi Luque et al. 在異體器官移植前,評估受捐者器官移植後可能發生排斥反應的機率。

FluoroSpot kits



ContentsFluoroSpotFLEX Build your own kitFluoroSpotPLUS Validated pre-coated kits
FluoroSpot plates
Non-coated
Pre-coated plates
Capture mAb(s)
O
In the pre-coated plate
Detection mAb(s)
O
O
Secondary detection ragents conjugated to fluorophores
O
O
Anti-CD3 mAb (positive control)*
O
Anti-CD28 mAb (for co-stimulation)*
O
O
R848+IL-2 (polyclonal activator)**
O
O
Fluorescence enhancer II
O
O
Size
1 and 10 plates
2 and 10 plates

* Included for certain cytokine analytes

** Included for certain immunoglobulin analytes

原廠文獻查詢

  • R. Bechara et al.(2019). Identification and characterization of a naïve CD8 + T cell repertoire for benzylpenicillin. Clin Exp Allergy. ;49(5):636-643.
  • Barutello et al. (2015) Antitumor immunization of mothers delays tumor development in cancer-prone offspring. OncoImmunology. 4:5, e1005500.​
  • Mullins, C. (2019) 'Human Colorectal Carcinoma Infiltrating B Lymphocytes Are Active Secretors of the Immunoglobulin Isotypes A, G, and M'. Cancers. 11(6):776.
  • Arlehamn, C. (2020) 'α-Synuclein-specific T cell reactivity is associated with preclinical and early Parkinson’s disease'. Nat Commun. 11(1):1875.
  • Birrueta, G. (2019) 'Variability in German Cockroach Extract Composition Greatly Impacts T Cell Potency in Cockroach-Allergic Donors'. Front Immunol. 10: 313.
  • Luque, S. (2018) 'A multicolour HLA-specific B-cell FluoroSpot assay to functionally track circulating HLA-specific memory B cells'. J Immunol Methods. 462:23-33.