從血液-血液混合樣品中,得到單一貢獻者的STR圖譜

Cover deconvolution of blood blood mixtures

混合樣品在法醫檢驗流程中的困境與嘗試改善方式

混合樣品的DNA分析,在法醫檢驗流程中一直是個難題。因為混合樣品在STR(short tandem repeat) 圖譜中,同一位點會顯示多個峰值,若是樣品中的DNA沒有主要貢獻者,更無法從峰值的強弱表現分辨出不同貢獻者的圖譜。另外,若能將混合樣品中的所有貢獻者,個別建立圖譜檔案,也有利於國家數據庫建檔,可用於日後比對。

基於這些原因,法醫科學家開發了幾種方式,目標是分離不同種的細胞。這些包括使用顯微切割(LCM) 或 流式分選(FACS) 來分離不同種細胞 ; 或是利用差異提取法(differential extraction method),分離精細胞與上皮細胞的DNA ; 還有利用ABO與CD45抗體微珠,分離不同來源的白血球等。更包括改善統計軟體,提高STR結果的分析效果。

DEPArray™ 技術平台的應用與突破

DEPArray™ 技術平台 (Menarini Silicon Biosystems) 使用不均勻電場產生電籠,可包裹細胞主動移動,配合螢光抗體標定與光學成像輔助,可捕獲與辨識出純粹的目標細胞,再依實驗需求以單顆細胞或群細胞方式回收,因此可以將混合物中不同種細胞分離回收。另一方面,同一種細胞群的細胞可以單顆回收,進行單細胞STR分析。 Menarini Silicon Biosystems還開發了DEPArray™ forensic sample prep kit ,可進行法醫樣品的前處理,與上皮細胞、白血球和精子細胞的螢光標定。此項技術也曾用於骨髓移殖後幹細胞嵌合體測定 ; Williamson et al. 用於性侵案件的混合樣品。

單細胞STR分析應用在法醫檢測中的困難

單細胞STR分析不常用於法醫DNA研究,主要是由於缺乏可靠方來分離單細胞。若可獲得單細胞,有文獻提到可使用微滴進行單細胞STR分析。

為了從混合樣本中獲得單一來源的犯罪者DNA圖譜,也可以從個別的皮膚碎片或是生物碎屑取得DNA,但這些來源和單細胞一樣,含的DNA非常少量,不適合常規STR流程中的DNA萃取與擴增。因此特殊的 DNA萃取方式(如單管裂解和擴增)和修飾的擴增方式(如低模板LT-DNA)。然而,提高擴增靈敏度,也增加了峰值不平衡,雜合基因座的雙峰值,以及基因座丟失率增加。導致圖譜判讀上的困難。

實驗驗證 : 單細胞STR應用在法醫流程

從包含2~3人的血液-血液混合樣品中,使用DEPArray™分離出單顆白血球,單管DNA裂解,把PCR 混合好的溶劑加到裂解DNA的管中,調整擴增條件,進行STR分析。

樣品製備方式有新鮮和存放多日,混合血液從棉棒或紙巾上收集,貢獻者2~3人。其單細胞的STR結果有差異,整體來說29個等位基因,出現一半以上。樣品存放時間若是越長(有測試存放2年的樣品),其單細胞STR分析成功比例越低,判斷應該是DNA品質影響測序結果。

總結來說,單個細胞的STR分析,由DEPArray™技術平台開啟法醫領域的全新可能性,特別是對於由相同種類的細胞組成的混合物類型。

資料來源 :
K. Anslinger · M. Graw · B. Bayer (2019) Deconvolution of blood-blood mixtures using DEPArray™ separated single cell STR profiling. Rechtsmedizin 29:33-40 https://link.springer.com/article/10.1007/s00194-018-0291-1


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