1. 哪一種WGA方法適用您的單細胞基因研究呢?–漫談單細胞全基因組定序分析

漫談單細胞全基因組定序分析系列文章-如何選擇適合WGA分析方法

前言: 踏出單顆細胞基因組分析的第一步
1. 哪一種WGA方法適用您的單細胞基因研究呢?
2. 擴增前樣品是單顆細胞,還是微量純化過的DNA?
3. 雙倍體基因體學,ADO影響分析結果
4. 樣品是新鮮或是固定過後的細胞,影響DNA模板完整性
5. 持續優化的單顆細胞基因組分析流程



目前WGA的方法大致可歸類為三種類型,以樣本為模板複製數百萬DNA片段達到基因組放大效果,分別為

分類說明舉例
1PCR – based以PCR的方式為主,進行基因擴增Ampli1 WGA Kit
2Random priming + PCR使用隨機引子,配合控溫PCR產生隨機片段擴增基因組Malbac, Picoplex, Genomeplex kit
3Random priming + isothermal amplification使用隨機引子,經Multiple Displacement Amplification (MDA)原理產生極長DNA聚合鏈擴增基因組Repli-G kit

進行WGA時,除了考量操作流程、成本、產量等因素外,於單顆細胞研究中,最重要的是於WGA過程中減少複製偏差產生,當樣品是少量細胞時,因極少量的複製偏差將會被大部分的正確複製產物稀釋或掩蓋,使得後續分子分析時較不受複製偏差影響導致判讀錯誤;然而當樣品是單顆細胞時,若有複製偏差產生,擴增產物會無法正確反應原本樣品的情況導致取得非真實的分析結果。

因引子的模板親和力基於其鹼基組成,使用隨機引子作為DNA聚合起始點時,將導致每次擴增放大的產物為隨機片段,另外隨機引子容易產生偏好性親和,導致基因組非平均擴增的狀況產生。

Ampli1™ WGA kit為現在市面上唯一完全不具有隨機過程的單顆細胞WGA試劑組;其擴增開始前,會先以限制酶辨認genome 的切位將其切成DNA片段,並於兩端皆接上相同的adaptor,如此一來只需以單一的高專一性引子辨認adaptor序列,藉由去除引子偏好性影響,配合控溫PCR,使整體擴增片段可預測。

Ampli1 Kit procedure

Ampli1 WGA kit過程包含幾大步驟

  1. 使用限制酶將genome切成19,046,047個DNA片段並於兩端產生相同sticky end
  2. 依照sticky end序列,於片段兩端接上相同adaptor
  3. 補完3‘序列
  4. 單一引子辨識adaptor序列,開始進行PCR擴增全基因組