B細胞分泌之免疫球蛋白測試-優化ELISpot分析中的刺激物

Cover optimization of b cell elispot assay for the analysis of vaccine

B細胞在免疫反應中的角色與分類

適應性免疫由T細胞與B細胞組成,而維持免疫記憶主要由2種B細胞負責,分別是長壽漿細胞(long-lived plasma cells) 和記憶B細胞(memory B cells)。長壽漿細胞主要存在骨髓中,可以持續釋放抗體。記憶B細胞主要存在外周淋巴系統中,與可以引發的抗原結合時,會分化成分泌抗體細胞 antibody-secreting cells (ASC)並且擴增。在感染其間或是接種疫苗之後,身體會產生長壽漿細胞和記憶B細胞,提供免疫記憶。

傳統常規檢測

常規檢測像是ELISA,通過檢測血清中的B細胞反應來當作抗原特異性抗體的指標,由於不包括記憶B細胞(memory B-cell)的活性檢測,所以無法涵蓋所有B細胞的反應。而記憶B細胞的快速分化與產生抗體的能力又與免疫能力高度相關。

1983年(Czerkinsky et all) 首次提出使用ELISPOT藉由偵測IgG的產量來推論B細胞活化狀態,IgG是抗體是人體免疫球蛋白中含量最高的抗體,約佔血液中抗體量的70~75﹪。之後進一步開發(Bernasconi et al., 2002, Crotty et al., 2004, Bauer and Jilg, 2006, Vallerskog et al., 2008, Buisman et al., 2009, Cao et al., 2010),可以在體外刺激有活性的漿細胞與B細胞,進而檢測預期免疫反應,可以使用在疫苗發展階段。然而,刺激物的選擇有多種組合,刺激的持續時間可能取決於活化的效力,適當的刺激物有助於提高檢測準確度與縮短實驗時間。

優化流程實驗驗證

研究中使用R848 + IL-2當作刺激物,與之前的方法(刺激物使用CpG + IL-2 + IL-10 + antigen)相比, 新方案有以下特點 :

  1. 實驗時間縮短
  2. 靈敏度提高
  3. 所需抗原(antigen)更少

建立的方法還使用5種疫苗來測試,包括白喉毒素diphtheria toxin [DT], 破傷風類毒素 tetanus toxoid [TTd], 百日咳毒素pertussis toxin [PT], 絲狀血凝素filamentous hemagglutinin [FHA] 和百日咳桿菌素pertactin [PRN])。都可以成功刺激B細胞與漿細胞,獲得免疫反應數值。

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memory bcell stimpack


資料來源

  1. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses, 2013, Journal of Immunological Methods https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022175913000653?via%3Dihub
  2. Optimization and qualification of a memory B-cell ELISpot for the detection of vaccine-induced memory responses in HIV vaccine trials, 2013, J Immunol Methods https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3736720/